采樣、包裝和運(yùn)輸
采樣
ASF 的任何實(shí)驗(yàn)室檢測都始于樣品采集。樣品采集過程中重要的考慮因素是調(diào)查的目的，例如診斷、監(jiān)測或無疫認(rèn)證。對哪些動(dòng)物采樣將取決于抽樣的目的。例如，當(dāng)調(diào)查疫情爆發(fā)( 被動(dòng)監(jiān)測) 時(shí)，應(yīng)對針對患病和死亡動(dòng)物，而在檢查動(dòng)物是否暴露于病原( 主動(dòng)監(jiān)測) 時(shí)，應(yīng)對年齡最大的動(dòng)物進(jìn)行抽樣。
負(fù)責(zé)抽樣( 并進(jìn)行臨床檢查) 的人員在開展相關(guān)操作前應(yīng)該接受過保定豬的技術(shù)培訓(xùn)( 包括臨床檢查和取樣)。
采樣小組應(yīng)根據(jù)采樣動(dòng)物的數(shù)量準(zhǔn)備充足的采樣設(shè)備( 見插文4)，并包含可能由于其他原因( 例如，失效的真空采血管) 而丟失或不可用的材料數(shù)量。另外，數(shù)據(jù)收集、個(gè)人防護(hù)/ 生物安全和樣品運(yùn)輸?shù)奈锲繁仨毎b( 參見插文4 中的“樣品運(yùn)輸材料”)。
建議準(zhǔn)備一份現(xiàn)場采樣表格，以便將現(xiàn)場收集所有樣品和相關(guān)信息統(tǒng)計(jì)到一起。如果預(yù)期將樣品提交給區(qū)域/ 國際參考實(shí)驗(yàn)室，建議一式兩份取樣，以便對提交的樣品進(jìn)行留樣，避免在反復(fù)凍融/ 分割樣品。
取樣應(yīng)小心謹(jǐn)慎，并按照適當(dāng)?shù)姆椒ū苊鈱?dòng)物造成過度的應(yīng)激或傷害，或?qū)Σ蓸尤藛T造成傷害。應(yīng)無菌收集并注意避免交叉污染，并始終使用新的針頭以避免疫病傳播。所有等待檢測的樣品都應(yīng)該被認(rèn)為有感染性并應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)處理。養(yǎng)殖場使用的所有采樣材料應(yīng)按照當(dāng)?shù)胤ㄒ?guī)進(jìn)行安全處理，例如，裝袋并運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行高壓滅菌/ 適當(dāng)處置。
提交到診斷實(shí)驗(yàn)室的相關(guān)樣品應(yīng)有清晰且保存持久的標(biāo)簽，樣品質(zhì)量良好。
樣品類型
a) 全血
使用含有抗凝血?jiǎng)?EDTA - 紫色蓋) 的無菌管( 真空采血管) 從頸靜脈、下腔靜脈或耳靜脈抽取全血。如果動(dòng)物已經(jīng)死亡，可以從心臟中采血，但必須立即進(jìn)行。
避免使用肝素( 綠色蓋子)，因?yàn)槠淇梢砸种芇CR 反應(yīng)(造成假陰性)，和/ 或由于紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)(HAD) 造成假陽性的產(chǎn)生。血液是PCR 檢測和病毒分離的目標(biāo)樣品。通過離心分離出的血漿可以用間接免疫過氧化物酶試驗(yàn)(IPT) 或間接熒光抗體(IFA) 試驗(yàn)進(jìn)行抗體的檢測。
通過干血斑(DBS) 進(jìn)行微量體積血液樣品的采集和儲(chǔ)存，以便進(jìn)一步進(jìn)行DNA和/ 或抗體檢測。這些卡片在偏遠(yuǎn)地區(qū)或者在無法冷鏈運(yùn)輸?shù)臅r(shí)候很有幫助，比如在熱帶地區(qū)的狩獵環(huán)境和農(nóng)村地區(qū)。然而，使用干血斑(DBS) 進(jìn)行非洲豬瘟檢測時(shí)，基因組和/ 或抗體檢測測試的靈敏度低于全血或血清樣品。通過將幾滴由刺血針或無菌注射器針頭從動(dòng)物的靜脈或皮膚滴加到特制的吸水濾紙中完成干血斑(DBS) 樣品的收集。血液樣品應(yīng)該完全浸透在濾紙，并風(fēng)干數(shù)小時(shí)。將樣品儲(chǔ)存在低透氣性的塑料袋中，加入干燥劑以減少濕度，即使在熱帶氣候下也可以保持在環(huán)境溫度中。
b) 血清
使用未加抗凝劑( 紅色蓋子) 的真空采血管從頸靜脈、下腔靜脈、耳緣靜脈，或剖檢過程收集血液樣品。返回實(shí)驗(yàn)室后，血液樣品應(yīng)在4±3℃下放置14-18 小時(shí)以分離血凝塊(譯者：此處與我國實(shí)際操作不同，僅供參考)。棄去凝固物，并離心10-15 分鐘后，回收澄清的上清液( 血清)。如果血清是紅色，這表明樣品發(fā)生了溶血，可以在酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 中產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。通常已經(jīng)死亡動(dòng)物的血液樣品易發(fā)生溶血( 例如野豬)。血清樣品在分離后可以立即開展抗體和病毒檢測，或者在<-70ºC 下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩τ诳贵w檢測，儲(chǔ)存在-20℃已足夠，但是對于病毒檢測，最好存于更低溫度。
c) 器官和組織樣品
雖然所有的豬器官和組織都可以用來檢查ASFV 的存在( 主要是該病的急性和亞急性的形式)，但目標(biāo)器官是脾臟、淋巴結(jié)、肝臟、扁桃體、心臟、肺和腎臟。
其中，脾臟和淋巴結(jié)是最重要的，因?yàn)橥ǔＫ鼈兊牟《竞渴亲罡叩摹９撬枰部捎糜谒劳鲆吧鷦?dòng)物病例，因?yàn)槿绻麆?dòng)物已經(jīng)死了一段時(shí)間，則骨髓可能是唯一相對保存完好的組織。可以通過關(guān)節(jié)內(nèi)組織液以檢查低毒力毒株的存在。建議將樣品保持在4℃，盡快(48 小時(shí)內(nèi)) 提交給實(shí)驗(yàn)室。如果由于物流原因無法保障的，樣品可以儲(chǔ)存在冷庫或液氮中。對于組織病理學(xué)研究，也可以同時(shí)提交用10% 緩沖福爾馬林浸泡的樣品。雖然這些樣品不能用于進(jìn)一步的病毒分離研究，但可用于PCR 反應(yīng)和免疫組織化學(xué)試驗(yàn)。
通過PCR 反應(yīng)、病毒分離和/ 或抗原檢測ELISA 的方法進(jìn)行病毒檢測時(shí)，需要將樣品用磷酸鹽緩沖液制備成10%(w / v) 的均質(zhì)組織懸液。在離心后，建議對上層清液進(jìn)行過濾，并用0.1% 的抗生素在4±3 ºC 處理1 小時(shí)。經(jīng)過勻漿處理組織可以立即用于ASFV 病毒和/ 或核酸的檢測，或存儲(chǔ)在< -70ºC 備用。對于PCR 反應(yīng)，建議對10 倍稀釋樣品或上清進(jìn)行檢測的同時(shí)，對未稀釋樣品也進(jìn)行檢測。從脾臟、肝臟和肺等臟器中提取的滲出物對于使用免疫過氧化物酶試驗(yàn)(IPT) 和間接熒光抗體試驗(yàn)(IFA) 方法檢測抗體非常有用(Gallardo，2015)。
d) 軟蜱樣品
鈍緣蜱屬軟蜱可以用于檢測ASFV 和病毒基因組。可從疣豬的洞穴、裂縫/ 洞穴中收集蜱蟲，有時(shí)也可以從豬圈內(nèi)的嚙齒類動(dòng)物的洞穴中收集。不同種類的蜱會(huì)有不同偏好的場所和棲息地。有三種收集技術(shù)：手動(dòng)收集、二氧化碳誘捕和真空吸引捕捉。收集后，應(yīng)讓蜱保持存活或直接儲(chǔ)存在液氮中，以確保蜱內(nèi)病毒的保存完好，并避免DNA 降解。
包裝和運(yùn)輸樣品
為了獲得正確的診斷，必須在適當(dāng)?shù)臏囟认隆⒁宰羁斓乃俣日_采集樣品。仔細(xì)進(jìn)行包裝、做好標(biāo)記并送到實(shí)驗(yàn)室。ASF 的診斷緊急，樣品必須通過最直接的路線送到最近的有資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室。樣品必須附有一份提交表格，具體說明樣品的數(shù)量和類型、種類、采樣地點(diǎn)( 根據(jù)具體情況填寫地址、縣、區(qū)、省、來源國家等信息)。此外，還列出了所需要的檢測項(xiàng)目、提交樣品人的姓名，以及觀察到的臨床癥狀、病變、發(fā)病率、死亡率、受影響動(dòng)物的數(shù)量、歷史和動(dòng)物種類。如果是家畜，應(yīng)該標(biāo)注養(yǎng)殖場的所有者、養(yǎng)殖場的名稱和飼養(yǎng)模式，再加上需進(jìn)行的鑒別診斷項(xiàng)目列表。每個(gè)樣品應(yīng)能對應(yīng)到來源動(dòng)物。填寫信息最低要求可能因?qū)嶒?yàn)室而異。采樣之前打電話給實(shí)驗(yàn)室，有助于確保遵循正確的提交程序，以保證所送樣品的數(shù)量能在一定時(shí)間內(nèi)能夠完成分析及儲(chǔ)存。
樣品應(yīng)盡快到達(dá)檢測實(shí)驗(yàn)室，以避免變質(zhì)并確保最佳效果。應(yīng)該保障運(yùn)輸過程中的安全，以免在運(yùn)輸途中感染其他動(dòng)物或人，并避免污染樣品本身。運(yùn)送的樣品必須有足夠數(shù)量的冷卻材料，例如冰袋，以防止變質(zhì)。如果樣品狀況不佳，則無法做出準(zhǔn)確的診斷。
陸地運(yùn)輸
將樣品運(yùn)送到最近的實(shí)驗(yàn)室時(shí)，即使樣品由獸醫(yī)服務(wù)人員攜帶，也必須遵守國家規(guī)定。如果沒有可用的規(guī)定，應(yīng)遵循《OIE陸生動(dòng)物診斷和疫苗手冊》中所述的聯(lián)合國示范條例2 (2016 年;第1.1.2 和1.1.3節(jié))。即使在公路運(yùn)輸?shù)那闆r下也應(yīng)使用三重包裝。圖27 列出了三重封裝特性的詳細(xì)例子。
航空運(yùn)輸
這些樣品應(yīng)該按照規(guī)定3 運(yùn)輸，并使用“三重包裝系統(tǒng)”。特別是如果樣品通過空運(yùn)運(yùn)輸，發(fā)貨人必須遵守國際航空運(yùn)輸協(xié)會(huì)(IATA) 的《危險(xiǎn)品條例(DGR)》，包裝應(yīng)符合《危險(xiǎn)品條例(DGR)》中的第6504 條包裝說明。
非洲豬瘟的診斷樣品被認(rèn)為是危險(xiǎn)的 — 必須被包裝，并正確標(biāo)記，以防止病毒的泄漏。因此，應(yīng)使用滿足規(guī)格的產(chǎn)品( 即符合國際航空運(yùn)輸協(xié)會(huì)(IATA) 運(yùn)輸診斷樣品的要求，如95KPa 壓力測試，跌落試驗(yàn))。要尋找該類型容器和包裝的供應(yīng)商，請?jiān)诨ヂ?lián)網(wǎng)搜索關(guān)鍵字，如“95 KPa”和“UN3373”、“瓶”、“管”、“袋子”，則通常會(huì)找到適當(dāng)?shù)男畔ⅰ?/span>
• 主要的容器. 樣品應(yīng)該儲(chǔ)存在防漏、防水、無菌的容器中( 這些應(yīng)該是主要的容器)，如圖27 所示。每個(gè)主要容器不得超過1 升。每個(gè)容器的蓋子應(yīng)用膠帶或石蠟?zāi)っ芊狻＿@些密封的主要容器應(yīng)該是用減震/ 吸收材料單獨(dú)包裝，以吸收容器或管子任何可能的泄漏，并防止沖擊。必須用防水墨水標(biāo)記每個(gè)容器，以明確識(shí)別來自于哪只動(dòng)物。
• 二次包裝.所有這些主容器應(yīng)放置在二次防漏、密封、防水的容器中，材質(zhì)可以為塑料或金屬。二次包裝必須能夠承受-40℃至55℃的溫度范圍，耐受95 KPa(0.95 bar)的內(nèi)部壓力，且無泄漏。吸收材料也應(yīng)放置在二次容器內(nèi)。如果將多個(gè)易碎的主容器放置在單個(gè)二次容器中，則必須單獨(dú)包裝或分離，以防止相互接觸。
注意1)由于存在發(fā)生爆炸的危險(xiǎn)，請勿將干冰放入主容器或二次容器內(nèi)。2)主要容器必須能夠承受-40℃至55℃的溫度范圍5，耐受95 KPa(0.95 bar)的內(nèi)部壓力，且無泄漏。
• 堅(jiān)硬的外部包裝. 二次容器必須確保用合適的緩沖材料外包裝。應(yīng)該已經(jīng)成功地通過了在1.2 米的高度的跌落測試，并標(biāo)有UN3373 標(biāo)記。外包裝在盛裝液體的情況下不得超過4 升，在固體物質(zhì)的情況下不得超過4 公斤。當(dāng)冷藏樣品時(shí)，不包括冰、干冰或液氮的重量。
樣品必須在4℃溫度運(yùn)送，通常為短期運(yùn)輸（1-2 天）
如上所述進(jìn)行包裝，如果空運(yùn)，應(yīng)根據(jù)國際原子能機(jī)構(gòu)(IAEA)包裝規(guī)范650，將樣品與制冷劑(足夠的數(shù)量以保持所需的溫度)放置在隔熱、堅(jiān)固的箱子進(jìn)行運(yùn)輸。
必須冷凍運(yùn)輸?shù)臉悠罚?20℃或-70℃）
對于超過三天以上的運(yùn)輸：這些材料也應(yīng)按指定的方式包裝，并在隔熱箱中添加足夠的干冰以保持溫度。確保二次包裝在箱子的中心是固定的，這一點(diǎn)很重要，因?yàn)楫?dāng)干冰分解的時(shí)候，二次容器會(huì)松動(dòng)。由干冰分解產(chǎn)生的二氧化碳?xì)怏w(CO2)降低PH 值并使病毒滅活;因此，所有主要和二次容器必須密封。當(dāng)干冰被用來在運(yùn)輸過程中冷藏樣品時(shí)，外部包裝必須允許釋放氣體(即不能密封)以防止壓力的積聚，從而破壞包裝。切勿凍結(jié)全血或含凝血?jiǎng)┑难濉?/span>
1. 標(biāo)簽和標(biāo)記
箱體外部(剛性外包裝)應(yīng)標(biāo)有以下標(biāo)識(shí) ：
1.“B 類生物物質(zhì)”標(biāo)簽(圖28)，其正確的運(yùn)輸名稱旁邊標(biāo)注“B 類生物物質(zhì)”;
2. 發(fā)件人的全名、地址和電話號(hào)碼;
3. 收件人的全名、地址和電話號(hào)碼;
4. 了解運(yùn)輸情況的負(fù)責(zé)人員的全名和電話號(hào)碼，如，負(fù)責(zé)人：姓名、+電話號(hào)碼;
5. 標(biāo)簽上標(biāo)明“在4 攝氏度”或“在零下70 攝氏度”保存。如果使用了干冰;
6. 貼有“干冰”標(biāo)簽(圖29);
7. 聯(lián)合國(UN) 編號(hào)和帶有干冰的正確運(yùn)輸名稱，后附有“作為冷卻劑”。干冰的凈數(shù)量(千克)必須清楚地寫在圖29 周圍，例如，UN1845、干冰、作為冷卻劑、凈重，## 千克。
2. 文件
運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室的樣品必須附有該實(shí)驗(yàn)室提供的申請表格，或者，如果不能提供，則提供附信。該信件應(yīng)包括有關(guān)動(dòng)物所有人、養(yǎng)殖場名稱、養(yǎng)殖場的所在地、飼養(yǎng)模式、涉及動(dòng)物、病史、臨床體征和死后病變的相關(guān)信息。必須注明所需的檢測項(xiàng)目。
運(yùn)輸單據(jù)：如果跨國境運(yùn)輸，需要進(jìn)口或出口許可證，以及實(shí)驗(yàn)室接受傳染性物質(zhì)診斷許可證的副本等(有時(shí)需要)。這些要求因國家而異。詢問接收方實(shí)驗(yàn)室進(jìn)口診斷樣品是否需要上述相關(guān)文件。
3. 運(yùn)輸
在運(yùn)輸樣品前，請盡早與接收實(shí)驗(yàn)室聯(lián)系并通知其有關(guān)預(yù)期的裝運(yùn)，包括詳細(xì)信息和大致的到達(dá)日期和時(shí)間。最好是安排送貨上門服務(wù)，直接送到實(shí)驗(yàn)室。一旦派送樣品，快遞員應(yīng)向目的地實(shí)驗(yàn)室提供其公司名稱，如果有的話，應(yīng)提供貨物的跟蹤號(hào)碼和/ 或空運(yùn)單號(hào)。如果使用空運(yùn)，有必要與接收實(shí)驗(yàn)室事先安排，在抵達(dá)機(jī)場時(shí)接收貨物(一些國際實(shí)驗(yàn)室有該系統(tǒng)，但也不是全部都有)。必須告知接收實(shí)驗(yàn)室航空公司的名稱、航班號(hào)和航空運(yùn)單號(hào)。嚴(yán)禁人員將傳染性物質(zhì)放入托運(yùn)或手提行李中，嚴(yán)禁隨身攜帶傳染性物質(zhì)。
運(yùn)輸分離/ 培養(yǎng)的非洲豬瘟病毒
分離/ 培養(yǎng)的ASF 病毒必須按照A 類感染性物質(zhì)運(yùn)輸。聯(lián)合國的編號(hào)是UN2900，正確的運(yùn)輸名稱是“感染動(dòng)物的傳染性物質(zhì)(非洲豬瘟病毒)”，并符合第620 號(hào)包裝要求。箱子外面的標(biāo)簽和標(biāo)記也是不同的。
《危險(xiǎn)品條例》要求所有參與運(yùn)輸?shù)娜藛T進(jìn)行適當(dāng)?shù)呐嘤?xùn)，特別是對A 類具有傳染性的物質(zhì)的運(yùn)輸，人員必須按照相應(yīng)的要求進(jìn)行培訓(xùn)，包括參加批準(zhǔn)的課程、通過考核和獲得認(rèn)證(有效期為兩年)。有關(guān)更多信息，請參閱《世衛(wèi)組織傳染病運(yùn)輸條例指南》。
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1. HR8000免疫定量速測儀
2. 霉菌毒素檢測試紙卡：黃曲霉毒素（AFB1）、嘔吐毒素（DON）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、T-2毒素（T-2）、伏馬毒素（FUM）、赭曲霉毒素（OTA）
3. 寵物疫病抗原檢測試紙卡：犬瘟熱病毒、犬細(xì)小病毒、犬冠狀病毒、貓瘟病毒、貓冠狀病毒等。
4. 豬病檢測試紙卡：豬瘟抗體檢測試紙卡、豬藍(lán)耳病抗體檢測試紙卡、豬口蹄疫抗體檢測試紙卡等
5. 禽病檢測試紙卡：禽流感H9亞型抗體檢測試紙卡、雞毒支原體抗體檢測試紙卡、雞滑液支原體抗體檢測試紙卡等。
6. 公司將于近期推出非洲豬瘟抗體檢測試紙卡，敬請關(guān)注。
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